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上海晶抗生物多重PCR試劑盒簡介：

多重PCR試劑盒是一種在普通PCR基礎(chǔ)上建立的一種可以同時擴增多個目的片段的檢測多種細菌分子生物學(xué)的技術(shù)，其利用多對特異性引物同時擴增，提高了擴增效率，節(jié)省了成本。優(yōu)點在于檢測的速度快、準(zhǔn)確性高和操作簡單，特別適用于臨床、環(huán)境和食品檢測等領(lǐng)域。

原理：

多重PCR試劑盒快速檢測通過堿基互補配對原則從而完成單鏈DNA的延伸工作，最終完成DNA雙鏈的配對合成。

多重PCR與常規(guī)PCR的區(qū)別在于同一個反應(yīng)體系中所加入的引物對數(shù)不同。多重PCR可以特異性擴增出多條目的DNA片段。反應(yīng)體系的組成和PCR循環(huán)的條件需要經(jīng)過優(yōu)化以確保同時擴增多個DNA片段。理論上只要PCR擴增的條件合適，引物對的數(shù)量可以不限，但由于各種條件的限制，實際能夠擴增的引物對數(shù)量是有限的（～1000對）。

材料與儀器：

目的菌株，胰蛋白胨，細菌DNA提取試劑盒，LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基；PCR熱循環(huán)儀，PCR擴增儀等。

步驟：

1. 引物設(shè)計：選擇序列長度在500bp以上的基因設(shè)計引物。先用Primer軟件，之后通過Oligo軟件和BLASTN算法進行分析，選擇二聚體少，自身不會形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，Tm值在60℃左右且與非DNA同源性較低的引物作為該基因的特異性引物，并送公司進行合成。最好進行引物評價實驗。

2. 提取目的菌株DNA：吸取樣品勻液，5000r/min離心后棄去上清，參照細菌DNA提取試劑盒進行操作，提取樣品的基因組DNA。

3. 測定DNA濃度及純度：當(dāng)260nm/280nm的比值在1.8-2.0之間表明提取的基因組DNA質(zhì)量較好。

4. 多重PCR檢測：將所提取的基因組DNA作為模板，以設(shè)計的引物（SU4,smal，clfA）進行多重PCR反應(yīng)，25μL多重PCR反應(yīng)體系為：2.5Μl10XPCRBuffer，1.0μLMgCl2（4mM），2.5μLdNTPMixture（各2.5mM），0.5μLTaq酶（5.0U），2.0μLDNA模板，引物（10umol），添加SU4,smal，clfA分別為2.6μL、0.5μL、1μL，ddH2O補足至25μL。

5. PCR反應(yīng)程序為：①94℃5min；②94℃30s；③58℃30s；④72℃45s；⑤72℃10min。②-④步重復(fù)30次。

6. 配置1.5%瓊脂糖凝膠，使用電泳檢測多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

7. 在EB液中染色10~15分鐘后置于凝膠成像儀下查看電泳條帶結(jié)果。

注意事項：

1. 當(dāng)比值大于2.0表明提取的基因組DNA中RNA含量較高，應(yīng)加入一定量的RNase酶去除溶液中的RNA。

2. 目的片段長度不盡相同，而較小片段總是優(yōu)先擴增；

3. 各對引物最佳PCR條件不相同，較長的片段需要較長的延伸時間。為了保證最終擴增產(chǎn)量的一致性，在優(yōu)化反應(yīng)條件的時候，盡可能選擇有利于較大片段的擴增條件。

4. 多重PCR體系中，引物用量與擴增的目的片段長度有著正比內(nèi)在關(guān)系，即擴增片段越長，所需引物相對越多，另外引物間的相互影響會導(dǎo)致擴增效果不佳。

5. DNA聚合酶的最適濃度為每25uL反應(yīng)體積中添加2U，實際根據(jù)擴增效果進行輕微調(diào)整。

6. 高鹽濃度會使長片段的擴增產(chǎn)物難于變性解鏈。因而長片段產(chǎn)物在低鹽濃度下擴增效果較好，而短片段產(chǎn)物在高鹽濃度下擴增效果較好。可以適當(dāng)提高PCR緩沖液濃度，或者提高K+濃度至70~100mM。

7. 不同的細菌類型和樣品類型可能需要不同的提取和擴增方法，需要根據(jù)具體情況選擇合適的方法。同時在進行PCR試劑盒擴增反應(yīng)時，需注意控制反應(yīng)條件和減少污染，以確保準(zhǔn)確性和可靠性。

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